Nova ferramenta eficiente para avaliar a exatidão das reações de CRISPR-Cas9
CRISPR-Cas9 é uma ferramenta excepcional, mas a tecnologia não é perfeita. Quando usado, às vezes produz inserções e deleções, conhecidos como indels, nos involuntários locais fora do alvo. Desde genes clivagens involuntários podem resultar em uma mutação inesperada, é crucial para detectar quaisquer erros no processo de CRISPR-Cas9. Em 19 de janeiro na Genome Research, a equipe de Kim na IBS apresentaram uma ferramenta que eles apelidaram de multiplex Digenome-seq (digerindo sequenciação de genoma), que pode mapear as especificidades do genoma de várias nucleases de CRISPR-Cas9 simultaneamente para encontrar e intencionar coisas indesejadas em um processo rápido e barato.
Primeiro autor explica que Daesik Kim "Digenome-SEQ difere de outros métodos baseados em células em que se detecta clivagem de ADN em vitro, em vez de em células, utilizando ADN genómico de células." Uma vantagem da utilização de ADN isento de células, é que ele produz resultados de análise precisa porque a cromatina, o que é normalmente encontrado na célula, não interferem com o processo. Além disso, porque o ADN em questão não necessita de ser amplificado utilizando PCR em massa antes da investigação; Digenome-seq é mais fácil, mais rápido e mais barato de usar do que os métodos anteriores, obras Digenome-seq, combinando DNA alvo livre de células com a proteína Cas9 e sgRNA (RNA de guia única) em vitro. O sgRNA leva a Cas9 para o alvo e para fora do alvo local do ADN onde fica clivado pela endonuclease Cas9. No estudo, os investigadores identificaram locais dentro e fora do alvo clivado
em vitro e frequências indefinidas medidas em centenas de locais alvos em células que poderiam tornar-se mutações não intencionais. Sua precisão é então registados com um sistema da equipa na IBS, que desenvolveu chamado o (índice de efeito fora do alvo) OTI singla em ingles de (Off-target Effect Index) que compara a proporção que está fora das frequências do alvo.
Ao contrário dos processos monoplex usados anteriormente que só pode trabalhar com um sgRNA de cada vez, o multiplex Digenome-seq realiza a análise simultânea de vários sgRNAs para detectar todos os seus locais do alvo ativo e fora do alvo simultaneamente. Este processo multiplex é mais rápidos, mais eficiente e mais rentável do que métodos anteriores. Para além da sua velocidade, Digenome-seq é capaz de detectar mais moléculas indels fora do alvo do que outros métodos, como HTGTS ou Guia-SEQ. O diretor da IBS Jin-Soo Kim disse "O CRISPR-Cas9 é uma descoberta científica incrível e vai continuar a ser o foco de biólogos de todo o mundo da investigação." Ele acrescentou que "Esta técnica pode ser usada para escolher os locais de destino com o mínimo de efeitos fora do alvo, um essencial método para aplicações terapêuticas de CRISPR-Cas9." Com precisão superior, redução de custos e velocidade, multiplex Digenome-Seq parece ser o novo padrão para a especificidade de testes CRISPR-Cas9.
[ ScienceDaily ]
